TD corrigé composé de 5 expériences à analyser sur la stimulation de la migration et de l'invasion des cellules cancéreuses du poumon par FAK (Focal Adhesion Kinaseet) et fibronectine de la matrice extracellulaire.
Sommaire
Expérience n°1
Expérience n°2
Expérience n°3
Expérience n°4
Expérience n°5
Expérience n°1
Expérience n°2
Expérience n°3
Expérience n°4
Expérience n°5
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Extraits
[...] Un contrôle avec la protéine GAPDH (dont l'expression ne varie pas suite à la transfection des cellules A549 avec le vecteur surexprimant si-FAK) a également été utilisé pour valider le western Blot. L'expérience de réparation de blessure montre qu'au bout de 10 heures, les cellules transfectées n'exprimant pas FAK (si-FAK) n'ont pas migré pour former une couche confluente, contrairement aux cellules exprimant FAK (si-Cx). En effet, une réduction significative drastique (d'un facteur 10 environ) du pourcentage de migration des cellules a été quantifiée. On peut en conclure que la protéine kinase FAK est indispensable au processus de migration cellulaire des cellules A549. [...]
[...] Src semble interagir directement avec FAK. Les résultats de la figure 4B révèlent une réduction marquée significative statistiquement du pourcentage de migration (de environ) et d'invasion cellulaire (de environ) des cellules traitées avec PP2, comparativement aux cellules non traitées (contrôle). Ceci signifie que la protéine Src est nécessaire à la fois à la migration et à l'invasion des cellules A549 sous l'effet de la fibronectine. Expérience 5 Le cycle d'activation/désactivation d'une petite protéine G se compose de quatre étapes : - Activation : la protéine G sous forme inactive (liée au GDP) est activée par un facteur d'échange nucléotidique de guanine (GEF) : la protéine est alors liée au GTP. [...]
[...] C'est aussi le cas de la protéine AKT qui est activée par la fibronectine puisque l'expression de sa forme phosphorylée augmente dès 15 minutes de traitement, de façon concomitante avec Src et ERK1/2. Au contraire, le traitement avec la fibronectine conduit à une très faible phosphorylation de la protéine PI3K (après et 90 min) qui est, de plus, transitoire car elle n'apparait pas au temps 120 minutes. Ainsi, la fibronectine semble activer les voies de signalisation Src, ERK1/2, Akt et dans une moindre mesure PI3K. [...]
[...] Pour cela, des lysats cellulaires issus de cellules A549 traitées avec de la fibronectine ou non (contrôle) pendant 120 minutes seront soumis à une co-immunoprécipitation avec les anticorps dirigés spécifiquement contre les formes phosphorylées de FAK. Après centrifugation ou application d'un aimant, on pourra récupérer les protéines précipitées avec l'anticorps et on éliminera les autres protéines contaminantes. On récupérera la protéine FAK et toute protéine qui interagit avec elle. On réalisera une élution du complexe par dénaturation. Puis on utilisera un SDS-PAGE que l'on transférera sur une membrane de nitrocellulose pour effectuer un western Blot. [...]
[...] On cherchera la présence de bandes spécifiques avec les deux anticorps (anti-FAK et anti-Src) dans les cellules traitées avec la fibronectine et celles non traitées (contrôle). Si une bande correspondant à la protéine FAK apparait ainsi qu'une bande correspondant à la protéines Src alors cela indiquera qu'il y a formation d'un complexe entre les formes phosphorylées de Src et de FAK sous l'effet de la fibronectine. Si ce n'est pas le cas, alors il n'y a pas d'interaction entre ces deux protéines et Src ne phosphoryle pas FAK. [...]
